现代生物技术导论

2020-03-03 01:36:38 来源：范文大全收藏下载本文

基因鉴定技术

一、概述

人体细胞有总数约为30亿个碱基对的DNA，每个人的DNA都不完全相同，人与人之间不同的碱基对数目达几百万之多，因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也因人而异，由此可以识别不同的人。所谓“DNA指纹”，就是把DNA作为像指纹那样的独特特征来识别不同的人。由于DNA是遗传物质，因此通过对DNA鉴定还可以判断两个人之间的亲缘关系。DNA鉴定技术的起源： DNA鉴定技术是英国遗传学家A·J·杰弗里斯（1950－）在1984年发明的。由于人体各部位的细胞都有相同的DNA，因此可以通过检查血迹、毛发、唾液等判明身份。

通过遗传标记的检验与分析来判断父母与子女是否亲生关系，称之为亲子试验或亲子鉴定。DNA是人体遗传的基本载体，人类的染色体是由DNA构成的，每个人体细胞有23对（46条）成对的染色体，其分别来自父亲和母亲。夫妻之间各自提供的23条染色体，在受精后相互配对，构成了23对（46条）孩子的染色体。如此循环往复构成生命的延续。由于人体约有30亿个核苷酸构成整个染色体系统，而且在生殖细胞形成前的互换和组合是随机的，所以世界上没有任何两个人具有完全相同的30亿个核苷酸的组成序列，这就是人的遗传多态性。尽管遗传多态性的存在，但每一个人的染色体必然也只能来自其父母，这就是DNA亲子鉴定的理论基础。

传统的血清方法能检测红细胞血型、白细胞血型、血清型和红细胞酶型等，这些遗传学标志为蛋白质（包括糖蛋白）或多肽，容易失活而导致检材得不到理想的检验结果。此外，这些遗传标志均为基因编码的产物，多态信息含量（PIC）有限，不能反映DNA编码区的多态性，且这些遗传标志存在生理性、病理性变异（如A型、O型血的人受大肠杆菌感染后，B抗原可能呈阳性。因此，其应用价值有限。

DNA检验可弥补血清学方法的不足，故受到了法医物证学工作者的高度关注，近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。在法医学上，STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继RFLPs（限制性片段长度多态性）VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。

一、基因鉴定技术中的亲子鉴定

亲子鉴定在现在社会应用越来越大。亲子鉴定又称父权鉴定、亲权鉴定，是应用医学、生物学及有关自然科学的理论、技术和方法，判断有异议的父母与子女是否亲生关系，特别是父与子女是否亲生关系的鉴定。

DNA亲子鉴定是目前最准确的亲权鉴定方法，如果小孩的遗传位点和被测试男子的位点（至少1个）不一致，那么该男子便100％被排除血缘关系之外，即他绝对不可能是孩子的父亲。如果孩子与其父母亲的位点都吻合，我们就能得出亲权关系大于99．99％的可能性，即证明他们之间的血缘亲子关系。

1、亲子鉴定技术的发展

早在三国时代，我国就已有以弟血滴兄骨验亲法，明代以后，有人应用“合血法”鉴定亲权关系。尽管上述方法不尽科学，但在用血型鉴定亲权的历史上，还是有较重要贡献的。

自1900年奥地利维也纳大学的Land-steiner发现ABO血型，使亲子鉴定建立在更加科学的基础之上。随着人类血液遗传多态性知识的不断发现和发展，新技术与新方法的不断建立和更新，测定血液遗传标记(geneti。marker，或GM)项目的不断增多，更使亲子鉴定在近一个世纪里，取得了巨大进展。之后随着免疫技术的充分利用又使多种血型系统被发现，如:MN、Rh、P、Lewis、Kell、nuffy、Kidd、oiego等，已相继有400多种红细胞抗原相继被发现。而电泳技术应用子血清蛋白和红细胞同工酶的分析，又开创了法医物证检验“血清型和酶型”时代。1955年Smithies等人首先报告了人血清在淀粉凝胶电泳中分出移动不同的区带，将结合珠蛋白(Hp)分为三种型;1962年Harris等用淀粉凝胶电泳检出血清拟胆碱酷酶的几种变异体;1963年Hopkinson等应用淀粉凝胶电泳检出了红细胞酸性磷酸酶(EAP)的五种表现型。结果促使血清型和酶型的检验迅速发展。但还存在着局限性，仍不能达到个人同一认定的水平。而随着DNA指纹、PCR技术在法医学中的应用，则开辟了“法医DNA分析”的新时代。这是法医物证检验的一个飞跃，它使法医物证检验达到了个人同一认定水平。在此后的十几年间，法医DNA分析技术飞速发展，在STI、(短串联重复序列)位点的复合扩增，mtDNA的序列分析及MVR一PCR(小卫星重复区域的数字编码法)等技术的研究上，尤其是在DNA体外扩增技术(PCR)上，都取得了相当进展。

2、亲子鉴定技术

2.1、血型和血清蛋白检测方法

早期人们主要根据脸型、指纹以及母亲的指控来认定亲子关系,显然很不可靠。人类血型被发现后,证明了它是个体的一种遗传标记,并很快被用于亲子鉴定,但由于血型的多态性程度有限,许多人可以表现同一血型,单凭血型检查结果,一般只能在某些情况下作出排除的结论,难以作出肯定的结论。直到70年代人类白细胞抗原(HLA)系统发现后,局面才得以改观,

因HLA具有高度的遗传多态性,使用HLA不仅能排除亲子关系,还能肯定某些亲子关系。肯定亲子关系时应计算亲子关系概率,按照国际标准,亲子关系概率应大于99.73%才能认定。单独进行HLA抗原检测,很难达到肯定亲子关系这一标准,因而常需同时进行其它血型标记检查,目前可用于鉴定的血型标记已达70多种。理论上,所检测的标记系统越多,结论越准确,但在实践中任何一个实验室都不可能无限制地检测过多的项目。以HLA抗原检测为主的亲子鉴定除尚需进行其它标记测定外,HLA抗原测定需要活细胞,采血后需及时测定,对于单亲的鉴定需要在进行家庭其它人员的检查后才能确定,因之这种方法已逐渐为DNA分型技术所替代。

2.2、DNA指纹

2.2.1、原理: DNA指纹(DNA Fingerprint,DFP)指根据DNA的多态性,个体的DNA用限制性内切酶切断后,片断的数目和长度具有高度的特异性,经过凝胶电泳,或以特定的探针(如放射性标记的Jeffreys33.6,33.15等探针)作Southern杂交,都能产生具有高度特异性的谱带,这种图谱在不同个体之间均存在明显差异性,与人的指纹相似,称为DNA指纹图谱.DNA指纹具有个体高度特异性、体细胞稳定性和种类稳定性的特点,而且这种特异性仍按简单的孟德尔方式遗传,成为目前最具吸引力的遗传标记,具有广泛的用途.譬如用于亲子鉴定,作为遗传标记辅助选择等等.

2.2.2、用DNA多态进行亲子鉴定存在的问题

(1)用DNA多态进行亲子鉴定比传统的血型和血清蛋白检测方法精确度高,但检测费用也较高。

(2)在实际应用中,DNA指纹图谱中的谱带较多,且各带的强弱不一,不易判读,对等位基因的判断较为困难.目前,多位点探针检测DNA片段的范围通常在4~24 Kb之间,小于4 Kb的基因组酶切片段可能很有意义,但不能判读.(3)对DNA指纹与特定组织性状之间的连锁关系还不十分清楚,连锁图谱远未完成,要做的工作还很多.

(4)特异探针尚未完全掌握,DNA指纹前景广阔但实际应用仍有很大的局限性.

另外,位点突变和无效等位基因对检测结果的影响也是影响鉴定准确性的问题。对于用微卫星位点进行亲子鉴定还存在着位点选择、包括位点的数量、与性染色体的连锁等,和结果分析等一系列标准的问题。

2.3、PCR-DNA分型技术

2.3.1、STR基因座的多态性: STR是短串联重复序列(Shorttandem repeat)的简称,也叫微卫星DNA (microsatellite)或简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR),是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列。其核心序列为2-6bp,重复次数通常在15~30次。多数的STR基因座具有多态性,其高度多态性主要源于核心序列重复次数的个体间差异,这种差异在基因传递的过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律。STR作为一个重要的遗传标记系统,已广泛应用于肿瘤生化研究、法医学个体识别、亲子鉴定和群体遗传学分析等领域。STR多态性一般是指由于核心序列重复次数不同而构成的长度多态性,但测序研究结果表明STR也存在着序列多态性。在实际应用中序列多态性的检测手段繁琐,对仪器设备要求高,故较少采用,而长度多态性检测已被广泛应用于法医学个人识别和亲子鉴定。

2.3.2、它的优点有:

PCR-STR分型进行亲子鉴定具有以下优点:

(1)采血量少,仅需5μl,不必静脉采血,手指采血即可;

(2)检测时间不受限制,过去进行以HLA检测为主的鉴定时,因需要活细胞,采血后需及时进

行操作,而本方法可随到随采;

(3)单亲也可进行鉴定,因这13个STR位点完全可以得到两个个体间是否可以认定的结论,完全可以达到国际标准所要求的亲子关系概率。

二、指纹技术应用

近一个世纪以来，指纹技术给侦破工作带来很大方便。但罪犯越来越狡猾，许多作案现场没有留下指纹。现在有了DNA指纹鉴定技术，只要罪犯在案发现场留下任何与身体有关的东西，例如血迹和毛发，警方就可以根据这些蛛丝马迹将其擒获，准确率非常高。DNA鉴定技术在破获强奸和暴力犯罪时特别有效，因为在此类案件中，罪犯很容易留下包含DNA信息的罪证。

根据DNA指纹破案虽然准确率高，但也有出错的可能，因为两个人的DNA指纹在测试的区域内有完全吻合的可能。因此在2000年英国将DNA指纹测试扩展到10个区域，使偶然吻合的危险几率降到十亿分之一。即使这样，出错的可能性仍未排除。