本科生毕业论文马瑞 修正
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本科生毕业论文（设计）
题
目
南四湖环棱螺基因组DNA的提取与鉴定
姓
名
马瑞
学号
2008142463
院
系
生命科学学院
专
业
生物科学
指导教师
曲志才
职称
教授
2012 年 5 月 20日 曲阜师范大学教务处制
目
录
摘要 ……………………………………………………………………………………1 关键词 …………………………………………………………………………………1 Abstract …………………………………………………………………………………1 Key words ………………………………………………………………………………1 引言 ………………………………………………………………………………………1 1 实验材料及方法 ………………………………………………………………………2 1.1 实验材料 ……………………………………………………………………………2 1.2 实验试剂 ……………………………………………………………………………2 1.3 实验器具 ……………………………………………………………………………3 1.4 实验方法 ……………………………………………………………………………3 1.4.1 从环棱螺肌肉组织中提取基因组DNA……………………………………………3 1.4.2 琼脂糖凝胶电泳 …………………………………………………………………3 1.4.3 DNA浓度、纯度及质量检测………………………………………………………4 2 结果与分析 ……………………………………………………………………………4 2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果…………………………………………………………4 2.2 紫外分光光度计检测结果…………………………………………………………4 2.3 实验结果分析………………………………………………………………………6 3 讨论 ……………………………………………………………………………………6 3.1 DNA电泳没出现条带的原因…………………………………………………………6 3.2 DNase的来源以及防止DNase的措施………………………………………………6 3.3 肌肉组织的不同保存方法对实验的影响……………………………………………7 3.4 实验材料的不同研磨方法对实验的影响……………………………………………7 3.5 检测基因组DNA提取效果的方法……………………………………………………7 致谢 …………………………………………………………………………………………8 参考文献 ……………………………………………………………………………………8
南四湖环棱螺基因组DNA的提取与鉴定
生物科学专业学生 马瑞
指导教师 曲志才
摘要：基因组DNA的提取技术是分子生物学研究中经常应用的最重要的实验技术。DNA作为遗传信息的载体，是分子水平实验操作的重要对象，纯度高、浓度高、完整性好的基因组DNA为基因的下游操作可以提供良好的保证。本实验采用经典的酚-氯仿抽提法，以南四湖环棱螺的腹足肌肉组织为材料分离提取高质量的基因组DNA, 用来进行以后的DNA克隆测序等实验研究。实验采用在-20℃条件下保存的肌肉组织为材料，利用SDS裂解细胞，蛋白酶K消化大部分蛋白质，最后用酚+氯仿+异戊醇除去剩余的蛋白质，通过异丙醇沉淀，得基因组DNA。利用琼脂糖凝胶电泳可检测所提取基因组DNA的浓度和质量。
关键词：基因组DNA；田螺；肌肉组织；酚-氯仿-异戊醇
Extraction and identification of genomic DNA from Nansihu river snail
Student majoring in Biological science
Name MaRui
Tutor
Qu Zhicai Abstract：Genomic DNA extraction method in application of molecular biology research is often the most important experimental techniques.As the carrier of genetic information, DNA is an important object of genetic manipulation.High purity, high concentration, integrity, good genomic DNA for gene downstream operations can provide a good guarantee.In this study the phenol-chloroform-isoamyl alcohol method was used to extract genomic DNA from muscle tiue of Nansihu river snail, which will be used for the experimental study of the DNA sequencing.It was used the muscle tiue which was preserved in -20℃ refrigeration, using SDS to lyse cells.Most of the protein was digested by proteinase K and the remaining protein was removed by phenol-chloroform-isoamyl alcohol.Through using isopropanol, genomic DNA can be precipitated.Agarose gel electrophoresis can detect the concentration and quality of extracted genomic DNA.Key words: genomic DNA; river snail; Muscle tiue; phenol-chloroform-isoamyl alcohol
引言 在基因工程中，核酸分子是主要的研究对象，因此核酸的分离、提取是分子生物学研究中很重要的技术。DNA作为遗传物质的载体，是分子水平实验操作的重要对象，纯度高、浓度高、完整性好的基因组DNA为基因的下游操作可以提供良好的保证。因此基因组DNA的提取是基因工程操作中最常用、最基本的实验技术，获得完整性良好的基因组DNA一直都是致力于基因工程研究的分子生物学者所面临的挑战性课题。尽管目前已经建立起许多基因组DNA分离提取方法并开发出若干DNA 分离提取试剂盒，但是，仍有不少实验材料由于富含的DNA酶、多糖、多酚等物质或者降解DNA，或者与DNA 形成难溶物等方式严重干扰DNA 的提取，常常导致实验的失败。就目前应用较为广泛的DNA提取方法而言，高盐法提取DNA虽然便捷，但所提取的DNA纯度较低，稳定性较差，影响基因下游操作。酚-氯仿抽提法已经广泛用于提取多种动、植物组织和细胞的基因组DNA，是比较常用的方法。本实验采用的就是酚-氯仿抽提法，原理是：SDS可以裂解组织细胞，使DNA从细胞中释放出来，蛋白酶K可消化部分蛋白质，并使DNA与蛋白质分离。通过水浴加热充分反应后，加入酚-氯仿-异戊醇等有机溶剂， DNA和变性的蛋白质分别位于整个体系的水层和中间层，从而分离。异丙醇能够夺去DNA周围的水分子，使DNA失水，得以沉淀，从而得到纯化的基因组DNA。
南四湖是山东省第一大淡水湖泊，其自然资源丰富，盛产鱼、虾等经济动物，苇、莲等多种水生植物。南四湖的田螺属于软体动物门，腹足纲，田螺科，环棱螺属。环棱螺的分布广泛、种群密度大，它与水产养殖、医学寄生虫、环境保护等方面的研究关系极为密切。多数淡水腹足类动物的个体小、数量多、耐污染性强，它们以水中的小型藻类、有机质等为食，其自身又是鱼类的天然饵料，对于维持水体的生态平衡和治理水体的富营养化等方面都有着重要的作用，近些年来受到国内外学者的高度重视。因此,对于这样一个与人类生活息息相关的物种,提取其基因组DNA是完全有必要的。同时，分离出纯度高、浓度高、完整性好的基因组DNA可以为许多后备实验做准备，如Southern杂交，PCR，基因定位，基因组文库的构建，基因组测序等，而且在分子水平对环棱螺分类地位的研究成效在很大程度上取决于提取的基因组DNA 的质量。基于此，本实验主要研究从南四湖环棱螺肌肉组织中快速有效地提取高纯度的基因组DNA。本研究采用酚-氯仿抽提法,目的在于分析研究南四湖环棱螺基因组DNA适宜的提取条件,并且分离出纯度高完整的基因组DNA，为分子生物学的深入研究奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验所采用的环棱螺取自南四湖，2011年采集的标本于95%的酒精中-20℃冷冻保存，2012年采集的标本进行活体解剖后，直接存放于-20℃冰箱中冷冻保存。根据所采集环棱螺标本的形态特征大致分为三种（详见表1）
表1 三种不同环棱螺采集信息
铜锈环棱螺 梨形环棱螺 方形环棱螺
采集点 南四湖5号 南四湖18号 南四湖7号
采集时间 2012年4月 2011年7月 2012年4月
采集个数
10 14 17
1．2 实验试剂
（1） 分离缓冲液：10mmol/L Tris-HCl(PH 8.0) 100mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl （2） 10%SDS：裂解组织细胞 （3） 蛋白酶K：消化部分蛋白质
（4） 酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）：除去少量蛋白质（苯酚：使蛋白质变性，蛋白质分子溶于酚相，DNA分子溶于水相。氯仿：一是使蛋白质变性，沉淀，通过离心除去：二是抽提水相里微量的苯酚，防止损伤核酸；三是除去样品中的脂溶性杂质。异戊醇：一是减少蛋白质变形过程中产生的气泡；二是有助于分相，使离心后上层含DNA的水相，中层变性蛋白质相，及下层有机溶剂相保持稳定） （5） 氯仿-异戊醇（24:1）：除去少量蛋白质
（6） 异丙醇：夺去DNA周围的水分子，使DNA失水，易于沉淀 （7） 70%乙醇：洗涤DNA （8） TE缓冲液：1×TE （9） 琼脂糖
（10）上样缓冲液（溴酚蓝）：电泳时跑在DNA前面，防止DNA跑出凝胶 （11）电泳缓冲液（1x TAE）
（12）溴化乙锭：嵌合剂，显示DNA位置 1.3 实验器具
移液枪、枪头、枪头台、EP管、离心管、试剂瓶、量筒、研钵、饭盒、大瓷钢、三角烧瓶、电子天平、电泳仪、低温离心机、DNA离心浓缩仪、蒸汽灭菌锅、冰箱、灭菌箱、手套、口罩、锡箔纸等。
1.4 实验方法
1.4.1 从环棱螺肌肉组织中提取基因组DNA （1）准备试验：配置试剂，现配现用的试剂要当天配制，其余的放入冰箱内备用；枪头、EP管等塑料试剂要用报纸包扎起来，放入高压蒸汽灭菌器内，120-121℃高压灭菌20min，再放入干燥箱内烘干备用；剪刀、镊子等仪器用锡纸包扎好于灭菌箱内200℃大约6h，备用；
（2）实验所用的环棱螺腹足肌肉组织材料，一部分取自95%的酒精中-20℃冷冻保存的肌肉组织，一部分取自刚解剖后立即-20℃冷冻的新鲜肌肉组织，取300-400mg组织进行实验。对于肌肉组织的研磨，在实验过程中采取三种不同的方式:第一，在研钵中用剪子将组织剪碎，分别放入4个1.5mL的离心管中；第二，用剪子将组织剪成小块后，加入研磨器进行研磨，在研磨过程中加入无菌水，以保证研磨充分，分别倒入4个1.5mL的离心管中，离心1min，取上清，保留沉淀；第三，用剪子将组织剪成小块后，在研钵中加入液氮，在冷冻的条件下迅速进行研磨，研磨成粉末状后，用药匙分装到4个1.5mL的离心管中。每个管中约70-100mg组织。向每个管中依次加入540μL TE缓冲液，60μL SDS，50μL蛋白酶K，充分震荡混匀；
（3）55℃水浴加热2-4h后取出，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀，4℃，12000r/min离心10min；
（4）将上清移至新的离心管中（这时EP管中已经分层，三层，中间为蛋白质，吸取上清是一定不能吸到中间层，以免混入杂质），加入等体积酚-氯仿-异戊醇，轻轻翻转混匀，4℃，12000r/min离心10min（再次离心的目的主要是再一次去除杂质，使DNA充分溶解出来）；
（5）将上清移至新的离心管中，加入等体积氯仿-异戊醇，轻轻翻转混匀，4℃，12000r/min离心10min；
（6）将上清移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，4℃，12000r/min离心10min；
（7）弃上清，向沉淀中加入70%乙醇洗涤沉淀， 12000r/min离心5min，弃上清保留沉淀，干燥5-10min，加入25μL TE缓冲液溶解，得到基因组总DNA。
1.3.2 琼脂糖凝胶电泳
（1）用胶带将胶板的两端封好，插上梳子； （2）电泳胶的制备（1%）
琼脂糖0.3 g，加入30mL TAE缓冲液，充分加热到沸腾无泡沫，冷却到大约60℃，再向胶中加入溴化乙锭 2L；
（3）倒胶：将融化的凝胶倒入胶模中（不要出现气泡），凝胶厚度大约在3-5 mm之间，在凝胶完全凝固后（室温下30-40 min），撕去胶带，轻轻拔出梳子；
（4）点样：取5L提取的基因组DNA溶液，与溴酚蓝混合后，慢慢将混合物加入上样孔中；
（5）小心地将玻璃板移至装有电泳缓冲液TAE的电泳槽中，且使缓冲液没过胶面。电泳槽中的缓冲液最好与制胶所用的缓冲液是同一批次的，若两种缓冲液中的离子强度及pH不一致，将影响核酸的迁移率；
（6）通电，使DNA向阳极移动。采用80V电压进行电泳； （7）当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后（约1 h），切断电流，取出玻璃板，在凝胶成像系统中观察并记录结果。
1.3.3 DNA浓度、纯度及质量检测
（1）取原液15μL，加TE缓冲溶液稀释到750μL (稀释50倍)，混匀，移至石英比色杯中，以750μL TE缓冲溶液为参比，用紫外分光光度计测定DNA在波长260nm、280nm处的吸收值。
（2）用以下公式进行计算：
DNA浓度(μg/μL) = D260×n(稀释倍数)×50(μg/mL)÷1000； 得率(μg/g)=DNA 量(μg)/样品量(g)； 根据OD260/ OD280判断DNA的纯度。
2、结果与分析
2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果
图1 三种不同环棱螺基因组DNA提取效果电泳图
1.铜锈环棱螺基因组DNA；2.梨形环棱螺基因组DNA; 3.方形环棱螺基因组DNA
三种环棱螺的肌肉组织均可以跑出较为清晰的条带，即三种环棱螺均可以提出较为完整的基因组DNA。实验结果显示，酚-氯仿抽提法可以有效的进行南四湖环棱螺基因组DNA的提取，并可以为许多后备实验做准备。但是各条带均有或多或少的拖尾现象，说明在实验过程中存在DNA的降解（图1）。
2.2 紫外分光光度计检测结果
用酚-氯仿抽提法提取三种不同环棱螺基因组DNA的紫外检测结果见表2。
表2 三种不同环棱螺基因组DNA的紫外检测结果
1 2 OD260 0.252 0.149
OD280 0.138 0.085
OD260/OD280 1.827 1.750
dsdsDNA浓度（μg/μL） dsDNA得率（μg/g）
0.6300 0.3725
189 111.75 3 0.371 0.203 1.828 0.9275 278.25 注：1.铜锈环棱螺基因组DNA；2.梨形环棱螺基因组DNA; 3.方形环棱螺基因组DNA A
B
C
图2 三种不同环棱螺基因组DNA的光谱扫描曲线 A为铜锈环棱螺基因组DNA的光谱扫描；B为梨形环棱螺基因组DNA的光谱扫描；
C为方形环棱螺基因组DNA的光谱扫描
从表2中可以看出，3种不同环棱螺基因组DNA的OD260/OD280比值都在1.70－1.85之间，说明提取的DNA纯度较高，用相同的方法提取不同种环棱螺的基因组DNA，都能够得到较高纯度。然而所提取的基因组DNA仍然存在污染，铜锈环棱螺和方形环棱螺DNA的OD260/OD280比值大于1.8，说明存在RNA污染，而梨形环棱螺DNA的OD260/OD280比值小于1.8，说明存在蛋白质污染。即便如此，从表中的数据可以看出，所提取的基因组DNA的浓度和得率均较为理想，说明酚-氯仿抽提法适合不同种环棱螺基因组DNA的提取。
2.3 实验结果分析
实验结果显示，酚-氯仿抽提法可以有效的进行南四湖不同种环棱螺基因组DNA的提取，并可以为许多后备实验做准备，如PCR，基因组文库的构建，基因组测序等。
实验过程中，由于很多因素的影响，如外界污染源的污染，加入有机溶剂酚-氯仿-异戊醇或氯仿-异戊醇颠倒混匀时过于剧烈导致基因组DNA断裂，水浴时间不充分使得细胞未能充分破裂释放DNA，从而导致一直未能够取得较满意的结果。异丙醇沉淀的步骤时，絮状沉淀有很多，但是不全部是DNA，还含有不少未除净的蛋白质（留在点样孔中）以及RNA（跑在前面），所以电泳的条带没有理想中的效果，会出现蛋白质杂质以及降解的DNA、RNA。然而目的条带基因组DNA仍然能够跑出来，可以继续基因组文库的构建以及基因的克隆、测序等后续操作。
3、讨论
3.1 DNA电泳没出现条带的原因
（1）所提取的DNA样品量太少或者样品中DNA已经被内源性DNase降解。（2）操作时没有严格按照提DNA的要求做，一般需要带手套，最好带上口罩，所有塑料用品需要高压蒸汽灭菌，实验的过程要在超净台上操作，尽量不让外源的DNA酶降解DNA。（3）研磨不充分，或者加入分离缓冲液、SDS、蛋白酶K之后，水浴时间不足，细胞未能充分破裂释放DNA。（4）加入有机溶剂酚-氯仿-异戊醇或氯仿-异戊醇后，颠倒混匀时过于剧烈，从而导致DNA断裂。（5）DNA未能与蛋白质充分分离，当除去蛋白质时，DNA随蛋白质一起被除去。（6）加入异丙醇沉淀离心10min后，DNA依然悬浮，未能沉淀到离心管底部，易随着液体被倒掉。这时，可以用移液枪小心吸出液体，再加入70%的乙醇洗涤，离心后，DNA可以沉淀。（7）在用移液枪吸取上清液时，未用剪过的枪头，从而在吸取时导致DNA链断裂。
3.2 DNase的来源以及防止DNase的措施
要进行PCR，基因组文库的构建以及基因组测序就需要得到完整的基因组DNA；而要得到完整的基因组DNA需要最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性DNase对DNA的降解。内源性DNase始终存在于肌肉组织中，最适pH值在7.0附近，活性在pH5～6区域稳定。外源性DNase稳定且广泛存在，操作者的手、唾液等含有较丰富的DNA酶，实验用试剂、器具等都含有DNase。DNase的活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。依据DNase的这一性质，在Tris-HCl缓冲液中加入EDTA，EDTA可以螯合二价阳离子，抑制DNase的活性。
然而不能因为加入了EDTA就放松了防止外界环境中DNase污染的警惕性。需要严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。为此，必须作到以下几点：
1.实验室应专门辟出操作区，离心机，移液器，试剂等均应专用。电泳槽、制胶板先用蒸馏水洗涤然后用70％的酒精处理，并且应保持清洁，定期行除菌。
2.操作过程中应戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的DNA酶带到试管或污染用具。避免在操作中说话聊天。也可以戴口罩以防止引起DNA酶污染。
3.尽量使用一次性的塑料制品，枪头、EP管等都应该用新的，以防交叉污染。
4．在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数。尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。
5.DNA电泳的电泳液和胶必须现配现用。
6.所用玻璃器皿、镊子剪刀等需先置于高压蒸汽灭菌锅内进行高压蒸汽灭菌。 3.3 肌肉组织的不同保存方法对实验的影响
本实验所用的田螺肌肉组织材料实验前进行了两种不同的处理方式。
在第一种处理方式中，将采集的田螺标本浸泡于95%的乙醇中，并于-20℃的冰箱中冷冻保存一年。一年后取出田螺标本，解剖，取肌肉组织进行实验，难以提出DNA。推测难以取得理想的实验结果的原因是多方面的，而主要原因可能是经过长时间乙醇的处理，肌肉组织变得坚韧，剪成粉末并加入SDS，蛋白酶K，进行水浴后难以将细胞充分裂解释放DNA，于是DNA则随蛋白质一起被除去；另一个原因则可能是经过长时间的保存，肌肉组织中的DNA已经被降解。
第二种处理方式，是将刚采集的新鲜田螺进行活体解剖，取其肌肉组织于-20℃的冰箱中冷冻保存，并在短期内进行实验。-20℃冷冻保存的原因是防止DNA被DNase降解（最好是在-70℃保存，由于实验条件限制，采取-20℃冷冻保存）。新鲜的田螺肌肉组织较软，进行充分研磨后加入SDS，蛋白酶K进行水浴，短时间内就可以使得细胞充分裂解，为后续的实验步骤做了充分的准备。从而使取得理想的实验结果成为可能。 3.4 实验材料的不同研磨方法对实验的影响
本实验，采取了三种方式对环棱螺肌肉组织进行研磨，具体的操作与实验效果如下： 第一种方式，是用镊子和剪子在研钵中将肌肉组织剪碎，尽量剪成粉末，来保证与SDS蛋白酶K的充分反应。然而，新鲜的肌肉组织较湿润，难以剪成粉末状，达到理想效果。从而在除去蛋白质时，由于DNA未充分释放，使得不少DNA随蛋白质一起被除去，造成实验材料的浪费，从而跑出的电泳条带颜色较浅，甚至无法跑出条带。
第二种方式是采用玻璃研磨器，将已经剪成小块的肌肉组织进行充分研磨，并加入无菌水将其研磨成浆，分装入离心管中后离心1min，研磨好的组织沉淀到管底，将水吸出，加入后续药品。这个方式可以使组织细胞与SDS，蛋白酶K充分反应，DNA得以充分释放，从而为跑出理想的条带做准备。但是这个方法步骤复杂，耗时较长，并且易在研磨过程中受到DNase的污染。
第三种方式是在研钵中将肌肉组织剪碎的基础上，加入液氮，在液氮冷冻下将实验材料迅速研磨成粉末，分装入离心管中，加入后续药品。采用液氮是实验中最常用也是最为正规的方式，在保证了研磨充分从而使得组织与药品充分反应的同时，也加快了研磨速度，有效的避免了DNase的污染。
3.5 检测基因组DNA提取效果的方法
对于实验中所提取的基因组DNA的提取质量，一般可采取三种方法进行检测。除了本实验中所采用的琼脂糖凝胶电泳的方法和紫外分光光度法以外，还有PCR扩增法：PCR反应条件为95℃预变性5min后，按照94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min的循环参数进行30个循环，最后72℃延伸10min终止反应。反应体系的组成为：dNTP混合物，10×PCR buffer，正向引物，反向引物（根据所扩增的区域选择引物），模板DNA，Taq酶，最后用双蒸水补足20μL。PCR产物在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳分离，用凝胶成像系统记录产物条带。
致谢
从开始写作至本论文最终定稿，总共花费了我一个月以来所有的业余时间。虽说在繁忙的工作之余要完成这样一篇论文的确不是一件很轻松的事情，但我内心深处却满含深深的感激之情。论文是在导师曲志才教授的悉心指导下完成的。导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。是曲导师让我能够静静地坐下来，在知识的海洋里吸取更多的营养，从而能够为自己进一步地加油充电。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！由于本理论水平比较有限，论文中的有些观点以及对企业示例的归纳和阐述难免有疏漏和不足的地方，欢迎老师和专家们指正。
本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学、朋友和学校的关心和帮助。在此感谢师姐陈思、师妹焦玉莲、师弟吕甲强、丁吉顺同学等等的指导和帮助；感谢实验室的所有老师和同志的指导和帮助；感谢曲阜师范大学的支持和帮助。没有他们的帮助和支持是没有办法完成我的学位论文的，同窗之间的友谊永远长存！ 参考文献
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