临检知识补充0121
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1、临床基因扩增检验实验室的设置及技术验收(上)
作者：佚名 文章来源：互联网 点击数： 517 更新时间：2009-8-10转载
临床基因扩增检验实验室的设置及技术验收(上)
李金明 卫生部临床检验中心 100730
临床基因扩增检验实验室设置完成并建立了相应的质量保证体系后，实验室就要申请验收，为使技术验收规范有效地进行，卫生部临床检验中心拟定了“临床基因扩增检验实验室技术验收表”，内容包括：（1）实验室设置和设备；（2）设施和环境；（3）人员；（4）设备管理；（5）检测方法；（6）标本管理；
（7）记录；（8）报告；（9）质量控制和（10）抱怨等十章共三十八条。其依据是《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）（以下简称《管理办法》）和《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字[2002]8号）（以下简称《工作规范》），下面对其作一简要解释。
一． 实验室设置和设备
本章共七条。要求实验室必须按照《管理办法》中的有关规定进行规范化分区，并且各区要有明确的标记，以及配备有开展临床基因扩增检验所必须有的仪器设备，满足《管理办法》和《工作规范》的要求。本章将每个区所应具备的基本仪器设备按随《管理办法》下发的《临床基因扩增检验实验室设置标准》完全列出，在验收时，对实验室进行逐条查对。
如何设置一个合格的实验室是每一个临床基因扩增检验实验室首先要遇到的问题，因为一个实验室一旦经过设置装修，如不符合要求，则会出现很大的麻烦，甚至不得不拆了重来。那么怎样才能设置一个合格的实验室呢？简单地说，就是十六个字，“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作”。同时要注意临床标本的接收问题。
对于临床基因扩增检验实验室的分区及其设备配置，在卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）中作了明确规定，并且卫生部临床检验中心发出的配套文件《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字[2002]8号）又对各区的功能及注意事项作了阐述。但具体到某一个实验室，如何根据自身的实际情况设置实验室，则仍常使实验室感到没底，因此，本处拟对临床基因扩增检验实验室设置和工作流程的一般原则再作一些具体的阐述，并尽可能举出一些实例加以说明。
首先是临床标本的接收问题。对于诸如血清（浆）、分泌物等临床标本，一个临床基因扩增检验实验室究竟应在何处对其进行接收、分离血清、编号乃至保
存较为合适？这是一个非常实际的问题，经常有同道提出来。
要回答这个问题，首先让我们来看一下临床标本送到实验室以后我们所要做的是什么？一般来说，当临床标本（如血液）送到实验室后，按照临床基因扩增检验质量保证对标本收集、运送和保存的要求，对标本接收编号后，即应尽快对其分离血清（浆）后保存待测，并且根据对临床标本较长期保存的要求，最好是在分离血清（浆）时，分出两管来，一管用于测定，一管长期保存备查。因此，最好是在四个独立测定区域之外的地方或区域内接收临床标本，有一台分离血清（浆）用离心机、一个超净台、一台冰箱、标本接收编号记录本、加样器及相应一次性经高压处理的消耗品（如吸头）即可。
通常，绝大部分实验室将临床标本的接收处放在标本制备区，而一个医院临床标本运送至实验室往往不会在同一个时间，标本来了就应该编号，并尽快分离血清（浆）或相应处理，这样就会因为临床标本的接收而使实验室工作人员频繁出入标本制备区，从而增加实验室污染的机会。而且由于条件所限，有相当一部分临床基因扩增检验实验室的设置为一个区套一个区的模式，要进入标本制备区就必须先进入试剂准备区，最后还只能经扩增区从产物分析区出实验室。这种情况下就必须将临床标本的接收处放在四个区之外的地方，可以与其它临床标本的接收、编号和保存处放在一起，关键是在分离处理标本时要注意防污染，所用器具符合要求并在超净台或生物安全柜中进行。
所接收的用于基因扩增检验的标本，应收集在原始密闭的一次性无菌容器中，不能接收从其它检测（如生化、免疫检验等）分出来的标本，以避免发生标本间污染的可能性。接收临床标本时，操作者应穿工作服及带手套，每份标本应放在适当的架子中，防止泄漏，并给出一个唯一编号。标本的保存按要求进行，冰冻通常在－20～－70℃条件下，避免反复冻融。在核酸提取时，由基因扩增检验实验室人员将标本带入至标本制备区。
关于基因扩增检验实验室设置的一般要求及工作流程。前面说到，要设置一个合格的实验室，就是要做到十六个字，“各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作”。
各区独立，其含义就是基因扩增检验实验室的四个区即试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区，应该是完全分开的各自独立的区域。而有的实验室在设置时，往往只是考虑实验室在形式上的分区，如实验室各区的分隔不完全，有相通之处；或一个区套一个区的实验室各区间无缓冲间或此类实验室有缓冲间却在装修时，采用家庭装修模式，即上吊推拉门或平开门，门的下面留有门缝；或实验室中央空调相通；或试剂物品传递窗密封不严等。
注意风向。由于基因扩增检验对原始靶核酸有一个指数扩增过程，因此，每次检测后，阳性标本均有大量的扩增产物存在，这种扩增产物如贮存于开放式容器，或在检测中的吸取，就会因为“产物气溶胶”的形成而扩散，极易对以后新的扩增反应产生“污染”。为防止这种污染的发生，就需要对基因扩增检验实验室在进行严格分区的同时，更要注意空气流向。关于这一点实验室通常会有什么样的误解呢？曾有同道说，准备将自己的基因扩增检验实验室装修成超净的实验室。这是没有必要的，因为基因扩增检验中的产物只是病原体如细菌或病毒核酸中的极小部分，通常也就一二百个核苷酸，这样小的分子可以说几
乎是无孔不入，通常的超净对其来说是没有用的。因此，最关键是要注意空气流向，防止扩增产物顺空气气流进入上游区域。基因扩增检验实验室的空气流向，通常可以通过实验室的相对正压或负压来达到目的。
为更清楚的说明注意空气流向的重要性，笔者在此提出，在临床基因扩增检验及使用基因扩增检验技术的科学研究中，要有“无基因”概念。众所周知，细菌、病毒是很微小的生物颗粒，看不见摸不着。当我们在进行细菌培养时，如果没有无菌概念，不严格按照细菌培养的无菌操作程序进行操作，就会造成杂菌污染，致使培养失败或受到干扰。在临床基因扩增检验中，“无基因”概念也就是要有防止以前扩增的“基因”对现有实验污染的概念。因为细菌、病毒虽小，基因更小。PCR扩增的只是细菌病毒核酸的一小部分。大到几百个碱基对，小到数十个。这么小的分子，可以说是无孔不入，很容易因为空气、人员物品的流动、操作的不规范而造成实验污染，出现假阳性结果。
因地制宜。基因扩增检验实验室不可能是千遍一律的，必须要具体情况具体分析。实验室各区既可是相互邻近，也可以分散在同楼层的不同处，甚至不同的楼层。新建实验室可以做得尽可能合理和规范，旧的实验室则只要符合标准即可，不必强求理想状态。如图1所示的实验室的设置都是符合要求的。
图1 符合要求的临床基因扩增检验实验室设置
方便工作。一是如标本制备区和扩增区等中间区域无法重复进入，要进入此类中间区域，就必须经各区域一圈；二是不便于工作服和工作鞋的换穿，试想当工作人员要进入一个区域时，属于正在工作区域的工作服和工作鞋如何脱换，于是不得不准备多套工作服和工作鞋。
经常有同道问，什么样的临床基因扩增检验实验室是最标准的？这通常很难界定，图1-2所给出的实验室设置图应是一个较为理想的设置模式。其有一个专用走廊，试剂准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区很规范地排列在一起，前三个区各有一个缓冲间，可供换工作服和工作鞋使用，顶上可装一紫外灯。内实验区域设为正压或常压状态，缓冲间内设为负压状态（可上设一抽风装置），使这三个区的空气流向为由实验区域内向外，以防止产物分析区内扩增产物的进入。缓冲间内通向内实验室和走廊的门可安装一种磁性连锁装置，当一个门打开时，另一门必须处于关闭状态，否则即打不开，防止出现两个门同时打开的情况。产物分析区可不设缓冲间（也可设），但应设为负压状态（装一个排风扇即可），使空气流向由外向内，以防止扩增产物的随空气流出。产物分析区也可设在远离上述三个区域的地方。每一区域都须有明确的标记，工作按试剂准备区、标本制备区、扩增区至产物分析区单一流向进行，各区的仪器设备包括工作服、鞋、实验记录本和笔等都必须专用，不得混淆。此外，上述四个工作区域内还应有固定于房顶的紫外灯，以便于工作后区域内的空气照射。
上述理想状况下临床基因扩增检验实验室的设置，在目前情况下，绝大部分临床实验室很难做到，本处也不做硬性要求，但以下几个基本的方面必须做到：
（1）四个区域必须是相互独立的；（2）各区的仪器设备及各种物品必须是专用的；（3）各区完全独立，缓冲间可有可无。如为一个区套一个区的模式，区间不能直通，应有缓冲间，供换工作服及鞋子用，并保证两个区域间始终处于完全的分隔状态；（4）产物分析区应安装排风扇或其它抽风装置。
1．试剂准备区
关于试剂准备区也有同道提出这样的问题，即使用所有试剂都已准备好备用的商品试剂盒时还需要试剂准备区吗？回答是当然不需要。但需注意的是，并非所有的商品试剂盒都是如此，有些尚需要实验室配备一些简单的试剂，如75%乙醇、DEPC处理水等。另外临床基因扩增检验实验室在某些情况下也会从事或帮助其它科室从事一些与基因扩增有关的研究工作，因而试剂准备区仍有必要设置，只不过是在空间上可以经济合理的考虑。
试剂准备区的仪器设备主要有加样器、天平和离心机等，除了要专用外，还应有定期校准。制备扩增反应混合溶液用的化学试剂应使用分子生物学级的，试剂制备好以后应有质检，质检包括两个方面，一是看是否有污染，即是否有假阳性存在；二是使用弱阳性质控物检测试剂的扩增检测效果。总而言之，实验室应建立一套适合于自身的试剂质检标准操作程序（SOP）。
2.标本制备区
对于临床基因扩增检验来说，标本制备区往往是首先进入的工作区域。该区域应限定只有本区的工作人员才能进入。同样，仪器设备、工作服及各种物品都必须专用。
进行核酸提取时，将标本从指定的标本接收及保存处拿至标本制备区，并进行有关记录。标本的制备最好是在生物安全柜内进行，可防止标本气溶胶的扩散。在标本制备的全过程中都应戴一次性手套，并经常更换，主要是因为在实验操作过程中，手套的污染很容易导致标本间的交叉污染。当处理可能具有传染危险性的标本时，最好是戴两副手套，当手套与标本有接触时即可弃掉外层手套。实验时所使用的加样器吸头必须带滤塞，并且要注意的是，滤塞不能是后插入的，而应是结合在吸头内壁上的巯水性膜滤塞，这样才能有效和可靠地防止气溶胶对加样器的污染。
在标本制备过程中，通常会有温育步骤。温育既可在加热模块也可在水浴中进行。当使用加热模块时，如在模块孔中填入二氧化硅细砂，然后将标本管置于细砂中温育，这样就可得到较为一致的温育温度。而当使用水浴时，则应使用可漂浮在水面上的试管架（如有孔海绵等）。加热模块和水浴每次使用时，都应该对所设置的温度使用已经校准的温度计进行校准。经高温温育后的标本应
冷至室温后再离心，使得由于加热回流的标本液体能离心至离心管底部。 标本制备区内的生物安全柜、超净台、加样器、离心机及其它设备都应使用10%次氯酸钠溶液消毒，然后用蒸馏水或70%乙醇洗涤去除残留的次氯酸钠，因为次氯酸钠对金属表面有氧化作用。
3．扩增区
扩增反应体系的配制和已提取核酸的加入可在标本制备区也可在本区内进行，关键是要防止产物的污染。如果空间允许的话，也可在一个独立的区域内进行。整个过程可在一密闭的带有紫外灯的防污染罩内操作，核酸模板样本加入时应使用带滤塞吸头，在打开及盖装有核酸模板样本的离心管盖时，要注意防止样本对手套指尖的污染。加样时，先加提取的核酸模板样本，每加完一个即盖好盖子，然后加阳性质控核酸模板，再就是标本制备阴性质控和仅含按样本一样稀释的主反应混合液的扩增阴性质控，这样做的目的是，最大可能地测出以前扩增产物的交叉污染。
扩增区的主要仪器就是核酸扩增热循环仪。热循环仪的电源应专用，并配备一个不间断稳压电源，以防止由于电压的波动对扩增测定的影响。此外，还应定期对热循环仪孔内的温度进行校准。每次扩增后，应使用可移动紫外灯对扩增热循环仪进行照射。对扩增孔内的消毒清洁，可首先用10%次氯酸钠浸泡的棉签逐孔消毒，再用蒸馏水或70%乙醇浸泡的棉签清洁。
4．产物分析区
产物分析区是临床基因扩增检验的最后一个工作区域，也是唯一能打开扩增后反应管的地方。由于本工作区应设置为负压状态，空气流向为由外向内，以防止扩增产物气溶胶流出，故本区可无缓冲间。
扩增产物的分析方法在目前国内已有国家药品监督管理局批准文号的试剂盒中现有两种方式，一是使用聚苯乙烯微孔板条作为杂交固相的微孔板上杂交；二是使用硝酸纤维素膜作为杂交固相的膜上杂交。使用微孔板上杂交模式，测定中严禁将孔内反应液或洗液倒入实验室水池内，而必须采取手工吸加或用洗板机洗板。如使用膜上杂交，同样不能将反应后的液体倒入池内，而应集中倒至1mol/L HCl溶液中，浸泡半小时以上后至远离基因扩增检验实验室处弃掉。 本区所使用的仪器设备可能有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等，酶标仪应定期校准，洗板机每次使用完都应进行清洗，其它如加样器和水浴箱可按有关方法进行校准。
本章的重点是实验室的规范化分区，怎样才能做到这一点，可参考上述中的有关论述。1.2中要求各区要有明确的标记，也就是说，在各区的门上要有一个明确指明该区是哪个区的标志，如试剂准备区、标本制备区、扩增区或产物分析区等，在各区或专用走廊的地面上最好有一个指示工作流向的箭头。1.3中要求实验室的设置要能防止扩增后区产物对扩增前区的污染，则主要是看实验室是
否有相应的措施和设施来保证空气的流向，如在扩增区和(或)产物分析区安装排风扇以保证这些区域内的相对负压；使用中央空调时各区是否有独立的进风和出风通道；以及各区间是否有完全的封闭性。1.4至1.7则各区所应有的最基本的仪器设备列出，看实验室是否具备，并要求实验室对各区的仪器设备及各种物品贴上专门的识别标识，如不同区的物品使用不同颜色如白色、绿色、黄色或者红色的标签进行标记，从而保证各区物品的专用性。本章所检查的内容属于实验室的硬件部分。要强调一点的是，进行传染性病原体检测的实验室需配备生物安全柜或抽风橱。
曾有同道问，在表的1.1中“⋯如使用全自动扩增检测仪，区域可适当合并”不是很明确，应说明究竟合并为几个区？由于测定技术总是在发展之中，区域的合并应根据仪器的特点而定，就目前而言，全自动扩增检测仪主要有实时荧光定量PCR仪、Cobas Amplicor等，根据这些仪器的特点，可以将扩增区和产物检测区合并为一个区，因此有三个区即可。还有同道问，如果不在扩增区内加样，或能保证所使用的扩增检验方法（如荧光定量PCR）不需在“扩增区”内加样，是否扩增区内列出的微量加样器可以不要？如果是这样的话，当然不必要。还有就是，是否一定要“可移动紫外灯”？配备“可移动紫外灯”主要是为了方便实验台面的紫外照射，因为紫外照射只有在60～90cm距离内有效，固定天花板上的紫外灯只能作为实验室空气的照射去污染。当然如果能在每一个实验台面上方60～90cm距离内安装一个紫外灯，也可不用“可移动紫外灯”，但这样的话，既不经济，也较难做到。
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