《生物制药技术》实验

2020-03-02 21:08:31 来源：范文大全收藏下载本文

《生物制药技术》实验指导

实验一金霉素链霉菌培养基的制备（验证型）

实验目的：

1、学会培养基的配制

2、掌握灭菌方法。实验原理：

金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。在固体培养基上产生金色色素，故名。其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。菌落开始为白色，长孢子后变青色。在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。抗菌素工业上用以生产金霉素。

放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。因其生长具辐射状，故名放线菌。放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。但其菌落较小而致密，不易挑取。不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。

四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。器材：

1ml移液枪；铝锅；电炉试剂：

NaBr母液（100 g／L） KCl母液（100 g／L）

M-促进剂母液（2.5 g／L）实验步骤： 1．种子培养基

种子培养基(g／L)：可溶性淀粉40，黄豆饼粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4， (NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先称取黄豆饼粉20g，单独煮沸10分钟，加入少量凉水降温，4层纱布压榨取汁，与其它称好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分装到250ml三角瓶中，每组2瓶。 2．定向发酵培养基

1 发酵培养基(g／L)：可溶性淀粉100，黄豆饼粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，酵母粉2.5， (NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同种子培养基，配好后分装到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分别加入如下成分，比较它们对四环素产量的影响：

(1) 对照(不加其他成分)；

(2) 加入NaBr母液至终浓度为2g／L； (3) 加入KCl母液至终浓度为2g／L；

(4) 加入NaBr母液至终浓度为2g／L及M-促进剂母液至终浓度为0.025g／L。每两组配一套。 3．灭菌

将封好口的培养基121℃灭菌30min。同时灭1ml 剪口移液枪头、1.5mL离心管。（总过程：称量——溶化——定容——分装——封口——灭菌）注意事项：

1．黄豆饼粉煮沸取汁。

2．培养基封口最好用8层纱布或棉花塞，最好不用橡胶塞，以增加透气性。 3．灭菌时锅内要补足水分。由于灭菌锅较大，升温排气一定要充分（10min）。补充阅读：

工业发酵中利用生产菌发酵得出最终产物是一个逐级放大的过程，各个不同的阶段对于营养成分的要求也各有特点，根据发酵不同阶段的要求，培养基可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。

孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：第一，营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。如灰色链霉在葡萄糖－硝酸盐－其它盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。第三，要注意孢子培养基的pH和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。

种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。最后一级的种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。

发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。

实验二金霉素链霉菌的定向发酵（验证型）

实验目的：

1、学习和掌握无菌操作技术。

2、掌握定向发酵四环素的原理。实验原理：

定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。

金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：

R1 R2 Cl H H OH H H

金霉菌原是产生金霉素（Chlortetracycline）的菌种，但因金霉素比四环素只多一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。另外，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强；当温度超过35℃时则只合成四环素。

本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。材料和试剂：

金霉素链霉菌：购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（菌种保藏号：CGMCC4.1043；订单号20111133 550元）。实验步骤：

前期准备工作：配制斜面培养基（可选，1号培养基由菌种保藏中心提供）

1、麸皮36.0 g， K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，琼脂 15～20 g，定容至1L，pH 7。

2、可溶性淀粉20g，KN O3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl

0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.2~7.5。

1、制备斜面孢子：将保藏的菌种的比例接种于液体培养基中（不加琼脂的斜面培养基），28℃下200 r/min振荡培养，将活化1d后的金霉素链霉菌种接入斜面培养基，28℃培养5～7天，金霉素土霉素四环素

3 待孢子长成灰色，于4℃冰箱中保藏。

2、种子培养：在斜面上用接种铲挑取1cm2左右生长良好的菌体接入装有50ml四环素种子培养基的250ml锥形瓶中， 230 r/min、28℃下振荡培养20～24h。

3、发酵培养：以剪口移液枪头取10 ml种子液接入装有100ml发酵培养液的500ml锥形瓶中（注意：同一处理组用同一瓶种子液接种），230 r/min、28℃下振荡培养5 d。用于后面的测定效价和薄层层析实验。

四环素的提取和精制（选作）

一、实验目的

1 ．掌握沉淀法精制四环素的原理、方法和基本操作技术。 2 ．熟悉pH 的控制与产量、质最的关系。

二、实验原理

四环素为两性化合物，其等电点为5.4 。当溶液pH 等于等电点时，四环素呈游离碱形式，从水溶液中沉淀出来。利用四环素的这一性质，可将四环素从发酵液中提取出来。

在连续结晶过程中，pH 的高低对产量、质量都有一定的影响。四环素的等电点为5.4 , 在pH 4.5~7.5 之间，游离碱在水中的溶解度乎不变。若pH 控制在接近等电点时，沉淀结品虽然比较完全，收率也高，但此时会有大量杂质同时析出，影响产品的色泽和质量；若pH控制得较低一些，对提高产品质量虽有好处，但沉淀结晶不够完全，收率会低些，影响产量。因此，在选择沉淀结晶pH 时，就必须同时考虑到产量、质量的效果。在正常情况下，工艺上控制pH4.8左右。若沉淀结晶质量较差，pH可控制得稍低些，有利于结晶质量的改善，但不能低于4.5，否则收率低，影响产量。

四环素的提取和精制分酸化、纯化、过滤、结晶和淋洗五个步骤。

(1 ) 酸化加入草酸，使积聚在菌丝体内的四环素尽可能多地成为可溶性盐，而转入液相。四环素在酸性条件下较隐定，且草酸与钙离子反应生成不溶性的草酸钙，析出的草酸钙能促进蛋白质的凝固，提高滤液的纯度和过滤速度。

( 2 ）纯化纯化剂（黄血盐、硫酸锌和硼砂）与草酸一起混合作用，可以除去发酵液中大量酸溶性蛋白质、铁离子和其他多种离子色素以及其他杂质，从而使滤液纯净，并减少发酵液的粘度，利于过滤。其中纯化剂黄血盐能与发酵液中的铁离子作用，生成普鲁士盐而除去铁离子。

( 3 ）过滤通过过滤，使四环素溶液与菌丝体以及其他杂质分离，再经过复滤、精滤，进一步提高滤液质址，得到澄清的滤液。

( 4 ) 结晶

将滤液的pH调节到等电点，在较低温度下析出纯净的四环素。

( 5 ）淋洗虽然发酵液经酸化后大部分四环素已溶入溶液中，但仍有部分残存在菌渣中，且过滤不可能十分彻底。所以用酸水淋洗，以提高收率。

三、实验试剂及仪器 1．试剂

300 g/L草酸溶液、200 g/L 黄血酸钾溶液、200 g/L 硫酸锌溶液、200 g/L 硼砂溶液、浓氮水、3 g/L草酸溶液。 2．仪器

1000 mL 烧杯、搅拌器、布氏漏斗、抽滤瓶、滤纸、量筒、pH 试纸、酸度计、温度计、水泵、表面皿。

四、实验步骤 1．酸化

取600ml 四环素发酵液，置装有机械搅拌的1000 mL烧杯中，开始搅拌，待发酵液温度降至20 ℃ 以下时，缓缓加入草酸溶液，草酸加入量为27～35g/L，并不时测定发酵液的pH。当发酵液pH为1.7~1.8 时（用酸度计测定），酸化完毕。 2．纯化

在酸化反应的烧坏中，按酸化的发酵液净体积，搅拌下依次缓慢加入纯化剂（黄血酸钾溶液、硫酸锌溶液、硼砂溶液），每种溶液终浓度均为2 g/L，加入时间间隔15min ，以便作用完全。 3．过滤

将布氏漏斗装于抽滤瓶上，铺好滤纸，开启水泵，用少量水将滤纸湿润，并使滤纸紧贴布氏漏斗。将纯化后的溶液缓缓倒入布氏漏斗，过滤滤液应完全澄清，否则必须重新过滤，直到完全澄清。 4.结晶

将抽滤瓶中的滤液倒入装有机械搅拌的1000 mL烧杯中，开动搅拌，并用水或冰水冷却。待滤液温度冷至5 ～ 7 ℃ 时，徐徐加入经过滤的浓氨水，并随时用pH 试纸测定溶液的pH，当pH 达到4 .6 ～4 .8 时（用酸度计测定），停止加入氨水，并继续搅拌2 h，使结晶完全。

装好布氏漏斗后，将上述液缓缓倒人布氏漏斗，过滤。结晶液全部倒入后，抽干。用35～45 ℃ 的热水充分洗涤粗碱3 次，抽干，再用0 .3 ％草酸洗涤，抽干。

五、注意事项

1．纯化搅拌时间不应少于2h，溶液温度保持在15 ℃ 以下。 2．pH 要调准确。

六、结果与讨论

1 ．计算四环素的得率。

2 ．讨论影响四环素得率和纯度的因素。

实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型）

实验目的：

掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。实验原理：

层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来 5 也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。

分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。

薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。

仪器和设备：

1.玻璃层析缸

2.层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售） 3.毛细玻璃管或微量注射器 4.紫外投射仪试剂：

四环素、金霉素标准品用0.01M盐酸溶解定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。展开剂：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5) 2L。凡士林实验步骤：

1．层析板处理

层析板105℃烘烤过夜，均匀喷上0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH4.5)，于空气中晾干、备用。

2．点样

选取两种定向发酵液加草酸酸化至pH为1.5～2.0，取上清约l .2 ml于1.5ml离心管中，10000 rpm，5min，备用。在距层析板底边2.5~3 cm起始线上(用铅笔划线，做出点样点记号)，用毛细玻璃管在薄层层析板上点四环素标准品和金霉素标准品溶液3次，发酵液上清点8～10次，点样点不大于0.4cm，每次都要吹干后再点。（一般效价在1000u／ml以上点3次，500～1000u／ml点4次，200～500u／ml点5次）。剩余的发酵液上清于4℃冰箱保存。

3.层析（展开）

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展开剂。层析前需预先用展开剂预平衡层析缸，可在缸中倒入2cm高的展开剂，密闭，一般保持15－30分钟。然后将层析板置于盛有展开剂的层析缸中，在室温下展层6～8h（与温度有关）。封口不严可涂抹凡士林。

4．荧光显影

待溶剂前沿展至板的一半以上时将层析板取出，标出溶剂前沿，于通风橱中晾干，用氨水熏数秒钟后即可在紫外灯下显影，画出黄色斑点，分别算出Rf值。（四环素标准品慢和金霉素标准品快）

6 无水四环素在波长365nm下显黄色荧光，根据与标准对照可定性测定。注意事项：

因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四环素尽量溶解。

点样时必须注意勿损伤薄层表面。要控制好点样量，样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象。

若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。

作展开剂中极少量强极性溶剂(0.5％)或pH值的改变可显著改善拖尾现象。

实验四四环素的效价测定（综合型）

实验目的：

1、了解抗生素效价的表示方法

2、学习抗生素的测定方法实验原理：

实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。效价(titer或titre)是评价抗生素效能的标准，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，也是衡量发酵液中抗生素含量的尺度，人们以1µg金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。

四环素和金霉素在酸性条件下，加热，可产生黄色的脱水金霉素和脱水四环素，其色度与含量成正比。

在碱性条件下，四环素较稳定，而金霉素则生成无色的异金霉素：

根据上述原理，可以在酸性条件下，利用比色法测定四环素、金霉素混合液的总效价；而四环素效价的测定可在碱性条件下，使金霉素生成无色的异金霉素，然后再在酸性条件下，使四环素生成黄色的脱水四环素，经比色测得四环素效价。总效价与四环素效价二者之差即为金霉素的效价。本实验只测定四环素的效价。

因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四环素尽量溶解。发酵液中，由于杂质的干扰，将影响比色的正确性，因此加入乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)作为螯合剂，掩饰金属离子的干扰，改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)，可以减少杂质对比色反应的干扰。实验步骤：

取上述保存的处理发酵液上清l ml (效价约为1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml浓度为lg／l00ml EDTA溶液，加蒸馏水9ml，再加入lml浓度为3mol／L的NaOH，在20~25℃下保温15min后，加入2.5ml浓度为6mol／L的HCl，煮沸15min后，冷却，稀释至刻度，在分光光度计上于440nm处测定其吸光度值。（紫外为100-390nm；可见光为380-780nm，根据波长选择石英比色池或玻璃比色池，否则玻璃对于紫外光有吸收）

对照样品（不加诱导剂）的前处理方法与上述步骤一样，只是在加入HCl后，不加热，稀释至刻度，作为测定样品的空白对照, 调零。

四环素标准品（1000U/ml）取1ml于50ml容量瓶中，加1ml浓度为6mol／L的HCl，水浴煮沸15min后，冷却，稀释至50ml，380nm测吸光度。（以蒸馏水作为空白测定）

以定向发酵培养基中的对照组作为空白对照，测定其它三个处理组的吸光度。（有时可能因对照组处理不当而使其它组的读数为负值，这时可以以蒸馏水作为空白。）

计算公式：

发酵液中四环素的效价=

A发酵 A四环素标准

×四环素标准品的效价