生物制药技术

2020-03-02 20:41:25 来源：范文大全收藏下载本文

酶

分离纯化酶的一般程序

1粗酶液的制备：材料的选择，发酵液处理，细胞破碎及酶的抽提 2酶的初步分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，离心分离 3酶的高度纯化（酶的精制）：层析法（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析），电泳（等电聚焦电泳）

4浓缩干燥及结晶：透析，旋转蒸发，超滤，冷冻干燥

酶的主要纯化技术－层析技术

利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数)，使各组分以不同的比例分布在两相中，当流动相以一定的速度流经固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组分分离的技术过程。称为层析技术（chromatography）

离子交换层析（ion exchange chromatography）

在一定的pH条件下，带电荷的蛋白质与高分子不溶性固定相偶联的离子交换基团相吸附，流动相中解离的离子与被吸附的酶发生可逆的交换，而对不同吸附能力的蛋白质进行分离离子交换剂的选择：阴离子交换剂用于处理净电荷为负的蛋白质，阳离子交换剂用于处理净电荷为正的蛋白质

样品在低离子浓度条件下上柱，逐渐增加洗脱液的离子浓度，使蛋白依次被洗脱下来洗脱方式可以是步进式洗脱或线性梯度洗脱洗脱液一般用 NaCl

凝胶过滤法（gel filtration）亦称分子筛层析、排阻层析，是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析分离的一种方法

凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；

分离提纯脱盐测定高分子物质的相对分子量

疏水层析（hydrophobic chromatography）

原理：蛋白质分子中含有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等疏水性较强的氨基酸，当蛋白质溶液经过疏水层析介质的疏水配基时，蛋白的疏水性集团（疏水补丁）会与疏水配基发生亲和作用而被吸附在介质上。不同蛋白质分子中疏水基团的数量和特性有所不同。在洗脱时通过改变洗脱液的极性达到分离的目的

亲和层析（affinity chromatography）

也称功能层析、生物专一吸附或选择层析。根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的方法酶与激活剂/抑制剂/底物/辅酶；抗原与抗体；激素/配体与受体；蛋白质与DNA/RNA上特定区域

特定的配基（激活剂/抑制剂/底物/辅酶）固定于惰性载体目的酶与配基特异性亲和吸附，杂质被洗脱改变洗脱条件，解除目的酶与配基的专一性结合

固定化酶（细胞）的定义

优点：

1.稳定性显著提高；

2.同一批固定化酶能重复多次地使用； 3.固定化后，很容易与反应物分开（过滤），不污染产物，而且有利于控制生产过程，同时也省去了热处理等使酶失活的步骤；

4.可长期使用，并可预测衰变的速度； 5.提供了研究酶动力学的良好模型。缺点：

①固定化时，酶活力往往有损失。 ②增加了生产的成本，初始投资大。

③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜。 ④非均相反应。

①注意维持酶的催化活性及专一性。在酶的固定化过程中，酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，而且要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。 ②固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。

③固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 ④酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。

⑤固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或溶剂发生化学反应。 ⑥固定化酶成本要低，以利于工业使用。

载体结合法

1物理吸附法2离子结合法3共价结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。 1）物理吸附法作用方式：非特异性物理吸附作用：范德华力；氢键；疏水作用；静电作用优点：制作简单，酶分子的构象很少或基本不发生变化，固定化酶活力较高缺点：酶与载体结合力弱，酶易从载体脱落载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等 2)离子结合法

作用方式：离子键结合

优点：制作简单，处理条件缓和，酶蛋白的活性中心和高级结构破坏较少，可以制得活力较高的固定化酶。

缺点：离子键结合较松散，如在高离子强度下进行反应时，酶与载体易分开。载体：多糖类离子交换剂，合成高分子离子交换树脂 3)共价键结合法

作用方式：共价键结合

优点：酶分子和载体间的共价键较牢固，有良好的稳定性及重复使用性缺点：制备过程复杂，反应条件比较剧烈，酶活性损失比较严重。

制作方法：先将载体活化，在载体上引入一个活化基团，然后该活化基团再与酶分子表面的基团（羧基/氨基/羟基）反应结合。有戊二醛法、重氮化法、烷基化法等。

交联法

利用双功能（或多功能）基团的试剂，使酶蛋白分子之间发生交联，凝集成网状结构而成为固定化酶

常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等。其中最常用的是戊二醛

包埋法

1网格型2微囊型

将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。

载体：凝胶，高分子聚合物（半透膜）

优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化。

缺点：酶被包埋在内部，对大分子底物很难发生催化作用。所以用包埋法制备的酶，一般只适用与小分子底物。

包埋法分为：网格包埋法和微囊包埋法。

酶传感器（enzyme sensor） 1生物传感器的概念

由生物识别物质（如酶、微生物、动植物组织、抗体等）和能量转换器相结合所构成的分析仪器，可以简便快速的测定各种特异性很强的物质要求识别物质对被测物具有高度的敏感性和选择性

根据识别物质可分为：酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器

2、生物传感器的一般结构与工作原理结构:有两个部分组成

生物分子识别元件（感受器）：酶、核酸、抗体、细胞等信号转换器（换能器）：电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、表面等离子共振器件等原理：待测物质经扩散作用进入生物传感器,通过分子识别发生特异的生物化学反应,产生的生化信号经换能器转换为可定量和可处理的电信号,进而可检测出该物质的浓度.根据反应产生的信号不同，可选择相应的换能器.

抗体

多克隆抗体：由于一个抗原通常都有几个抗原决定簇，因此每个免疫细胞都可能产生一种针对某一抗原决定簇（antigenic determinant）的抗体，这些由同一抗原产生的不同抗体统称为多克隆抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibodies，PcAb）。

单克隆抗体：单一类型的只针对某一抗原决定簇的抗体分子，是由单一的B淋巴细胞克隆产生的结构和特异性完全相同的高纯度抗体。

抗原的制备

1.用基因工程技术制备重组蛋白抗原

2.提取纯化天然抗原

3.合成多肽半抗原

4.小分子半抗原

5.多肽半抗原及小分子半抗原与载体偶联

免疫

动物选择：Balb/c小鼠，品系一致

途径

体内，体外，脾内免疫

筛选阳性克隆及克隆化

克隆：由单个细胞繁殖扩增而形成性状均一的细胞集落的过程。

目的：筛选阳性克隆；确保杂交瘤细胞所分泌的抗体具有单克隆性以及从细胞群中筛选

出具有稳定表现型。

筛选阳性克隆鉴定

单克隆抗体活性检测方法：

1）酶联免疫吸附实验（ELISA）：可溶性抗原、细胞核病毒。 2）放免测定（RIA）：可溶性抗原、细胞抗体。 3）FAC（荧光激活细胞分选仪，流式培养仪）：针对细胞表面

抗原的抗体检测。

4）IFA（间接免疫荧光法）：用于细胞和病毒抗体的检测。

杂交瘤细胞的克隆化

（1）有限稀释技术柏松分布（2）半固体琼脂培养法

0.5%琼脂培养基中进行克隆

1ml含不同数量的细胞悬液

1ml42度0.5%的琼脂液

单克隆抗体的大量制备

基因工程抗体（genetically engineered antibodies,gAb）

是通过基因工程技术研制的，即通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体。基因工程抗体既保持了单抗的均一性、特异性强的优点，又能克服其为鼠源性的不足，是拓展单抗广泛人体使用的重要途径。

（一）嵌合抗体（chimeric antibody）

特点：是用人抗体的C区替代鼠的C区。效果：使鼠源性单抗的免疫原性明显减弱，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学。嵌合抗体的优点：

保持了亲本鼠单抗的特异性和亲和力；

减少人源性的恒定区的HAMA现象；

能有效地介导产生补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）及免疫调理作用。缺点：

目前已有数十种嵌合抗体进入了临床试用，虽然HAMA现象较鼠单抗大为下降，但有相当比例的患者仍会出现HAMA症状，针对可变区的抗独特型抗体反应仍很明显。

（二）改型抗体（reshaped antibody，RAb）亦叫“重构抗体”，“CDR移植抗体（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定区（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改换成鼠源单抗CDR 序列。

特点：此种抗体可以使人单抗获得鼠单抗的特异性又保持人源抗体的亲和力。

动物

动物细胞分类

1、贴壁依赖性细胞概念：anchoraged-dependent cell需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞大多数动物细胞都属于此类。

2、非贴壁依赖性细胞

概念：anchoraged-independent cell不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中悬浮生长，被称为悬浮细胞。举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞，Namalwa细胞。

3、兼性贴壁细胞

概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想的药物生产细胞系

转基因技术的基本原理

将体外构建的重组DNA分子(目的基因或基因组片段)通过显微注射、或转染胚胎干细胞等方法注入动物的受精卵或着床前的胚胎细胞,然后将此受精卵或胚胎再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带外源基因的转基因动物。

同源重组

双链DNA的两个区段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源区。同源的双链DNA可以通过相互交换进行重组。

外源DNA如有同源区，也可通过类似的同源重组过程整合到生物的染色体基因组上。

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES）是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多潜能细胞系，具有胚胎细胞相似的形态特征和分化特征。

新型

反义技术：根据碱基互补原理，使用与目标靶的遗传物质（DNA或mRNA）特定互补的核苷酸片段来封闭基因表达的技术方法。

反义药物：人工合成或生物合成的DNA或RNA，能与RNA互补，抑制疾病基因的表达。反义核酸（antisense nucleic acid）是一段与靶基因的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列。它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点。

核酶(ribozyme) 具有酶活性的RNA，可降解特异的mRNA序列。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）

由双链RNA介导的细胞内特异性mRNA降解过程，导致靶基因的表达沉默。

基因导入方式

直接体内疗法（in vivo）

是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。间接体内疗法（ex vivo）

是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。

肿瘤的基因治疗

（一）通过抑癌基因抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡。

（二）通过病毒感染杀伤肿瘤细胞

（三）通过诱导免疫系统识别并杀伤肿瘤细胞

（四）肿瘤的自杀基因治疗